Proteinazo K mNGS (likva)
Proteinazo K estas stabila serinproteazo kun larĝa substratspecifeco.Ĝi degradas multajn proteinojn en la indiĝena stato eĉ en ĉeesto de lesivoj.Indico de kristalaj kaj molekulaj strukturstudoj indikas ke la enzimo apartenas al la subtilisinfamilio kun aktiva eja kataliza triado (Asp39-Lia69-Ser224).La superrega loko de fendetiĝo estas la peptidligo najbara al la karboksilgrupo de alifataj kaj aromaj aminoacidoj kun blokitaj alfa-aminogrupoj.Ĝi estas ofte uzata pro sia larĝa specifeco.Tiu proteinazo K estas speciale dizajnita por mNGS.Kompare kun la alia proteinazo K, ĝi enhavas eĉ malpli da nuklea acida poluado kun la sama enzimeca agado, kiu povus pli bone certigi la kontraŭfluan mNGS-aplikaĵon.
Kondiĉoj de Stokado
2-8 ℃ dum 2 jaroj
Specifo
| Aspekto | Senkolora ĝis helbruna likvaĵo |
| Aktiveco | ≥800 U/ml |
| Proteina Koncentriĝo | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Neniu detektita |
| DNase | Neniu detektita |
| RNazo | Neniu detektita |
Propraĵoj
| EC-numero | 3.4.21.64(Rekombinaĵo de Tritirachium-albumo) |
| Izoelektra punkto | 7.81 |
| Optimuma pH | 7.0- 12.0 Fig. 1 |
| Optimuma temperaturo | 65 ℃ Fig. 2 |
| pH-stabileco | pH 4,5- 12,5 (25 ℃, 16 h) Fig. 3 |
| Termika stabileco | Sub 50 ℃ (pH 8.0, 30 min) Fig. 4 |
| Stoka stabileco | Pli ol 90% da aktiveco dum 12 monatoj ĉe 25 ℃ |
| Aktivigantoj | SDS, ureo |
| Inhibidores | diisopropil fluorofosfato;fenilmetilsulfonila fluorido |
Aplikoj
1. Genetika diagnoza ilaro
2. RNA- kaj DNA-ekstraktado-kompletoj
3. Eltiro de ne-proteinaj komponantoj el histoj, degradado de proteinaj malpuraĵoj, kiel DNAvakcinoj kaj preparado de heparino
4. Preparado de kromosoma DNA per pulsita elektroforezo
5. Western blot
6. Enzimaj glicosilitaj albuminreakciiloj en vitro-diagnozo
Antaŭzorgoj
Portu protektajn gantojn kaj okulvitrojn kiam vi uzas aŭ pezas, kaj konservu bone ventolitajn post uzo.Ĉi tiu produkto povas kaŭzi haŭtan alergian reagon kaj gravan okulan koleron.Se enspirata, ĝi povas kaŭzi alergiajn aŭ astmajn simptomojn aŭ dispneon.Povas kaŭzi spiran koleron.
Unuodifino
Unu unuo (U) estas difinita kiel la kvanto de enzimo necesa por hidrolizi kazeinon por produkti 1 μmol.tirozino por minuto sub la sekvaj kondiĉoj.
Preparado de reakciiloj
Reakciilo I: 1g laktokazeino estis solvita en 50ml da 0.1M natria fosfata solvaĵo (pH 8.0), kovita en 65-70 ℃ akvo dum 15 minutoj, movita kaj solvita, malvarmigita per akvo, ĝustigita per natria hidroksido al pH 8.0, kaj fiksita volumeno. 100 ml.
Reakciilo II: 0.1M trikloroaceta acido, 0.2M natria acetato, 0.3M acetacido.
Reakciilo III: 0,4M Na2CO3solvo.
Reakciilo IV: Forint-reakciilo diluita per pura akvo 5 fojojn.
Reaktivo V: Enzima diluilo: 0.1M natria fosfata solvo (pH 8.0).
Reakciilo VI: tirozina solvaĵo: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tirozino solvita kun 0,2M HCl.
Proceduro
1. 0,5 ml da reakciilo I estas antaŭvarmigita al 37 ℃, aldonu 0,5 ml da enzima solvaĵo, bone miksu kaj kovu je37 ℃ dum 10 minutoj.
2. Aldonu 1ml da reaktivo II por ĉesigi la reagon, miksi bone kaj daŭrigi la kovadon dum 30 minutoj.
3. Centrifuga reago solvo.
4. Prenu 0,5 ml de supernatante, aldonu 2,5 ml de reaktivo III, 0,5 ml de reaktivo IV, bone miksu kaj kovu je 37 ℃.dum 30 minutoj.
5. OD660estis determinita kiel OD1;Blanka kontrolgrupo: 0.5ml reaktivo V estas uzata por anstataŭigi enzimonsolvo por determini OD660kiel OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. L-tirozina norma kurbo: 0.5mL malsama koncentriĝo L-tirozina solvo, 2.5mL Reaktivo III, 0.5mL Reaktivo IV en 5mL centrifuga tubo, kovu en 37℃ dum 30min, detektu por OD.660por malsama koncentriĝo de L-tirozino, tiam akiris la norman kurbon Y=kX+b, kie Y estas la L-tirozina koncentriĝo, X estas OD600.
Kalkulo
2: Tuta volumo de reagsolvo (mL)
0.5: Volumo de enzimsolvo (mL)
0.5: Reakcia likva volumeno uzata en kromogena determino (mL)
10: Tempo de reago (min)
Df: Diluo multobla
C: Enzima koncentriĝo (mg/mL)
Referencoj
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biophys.Res.Commun.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,Eur.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Molecular Cloning: Laboratory Manual, dua eldono, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Figuroj
Fig.1 Optimume pH
100mM bufrosolvo:pH6.0-8.0, Na-fosfato;pH8,0-9,0, Tris-HCl;pH9.0-12.5, Glicina-NaOH. Enzima koncentriĝo: 1mg/mL
Fig.2 Optimuma temperaturo
Reago en 20 mM K-fosfata bufro pH 8.0.Enzima koncentriĝo: 1 mg/mL
Fig.3 pH Stabileco
25 ℃, 16 h-traktado kun 50 mM bufrosolvo: pH 4.5- 5.5, Acetato;pH 6,0-8,0, Na-fosfato;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9.0- 12.5, Glicino-NaOH.Enzima koncentriĝo: 1 mg/mL
Fig.4 Termika stabileco
30 min-traktado kun 50 mM Tris-HCl-bufro, pH 8.0.Enzima koncentriĝo: 1 mg/mL
Fig.5 Stokado stabilaty at 25℃
