Hotstart Taq DNA Polymerase
Hot Start Taq DNA Polymerase (Antikorpa modifo) estas varmega termostabila DNA-polimerazo de Thermus aquaticus YT-1, kiu posedas 5′→3′ polimerazan agadon kaj 5′ klapon endonukleazan agadon.La varma-komenca Taq DNA-polimerazo estas Taq DNA-polimerazo kiu modifita per termolabile Taq-antikorpoj.Antikorpa modifo pliigis specifecon, sentemon kaj rendimenton de PCR.
Komponentoj
| Komponanto | HC1012A-01 | HC1012A-02 | HC1012A-03 | HC1012A-04 |
| 5×HC Taq Buffer | 4 × 1 ml | 4 × 10 ml | 4 × 50 ml | 5 × 400 ml |
| Hot Start Taq DNA Polymerase (Antikorpo modifita) (5 U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 5 ml | 10 × 5 ml |
Aplikoj
10 mM Tris-HCl (pH 7,4 ĉe 25 ℃), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitolo, 0,5% Tween20, 0,5% IGEPALCA-630 kaj 50% Glicerolo.
Kondiĉo de Stokado
Transportado sub 0 °C kaj stokita je -25 °C ~ -15 °C.
Unueca Difino
Unu unuo estas difinita kiel la kvanto de enzimo kiu korpigas 15 nmol da dNTP en acidan nesolveblan materialon en 30 minutoj je 75 °C.
Kontrolo de kvalito
1.Endonukleaza Aktiveco:Kovado de 20 U da enzimo kun 4 μg pUC19 DNA dum 4 horoj je 37 ℃ rezultigis neniun konstateblan degeneron de la DNA kiel determinite per ĝelelektroforezo.
2.5 kb Lambda PCR:25 Cikloj de PCR-plifortigo de 5 ng Lambda DNA kun 1.25 ekzempleroj de Taq DNA Polymerase en la ĉeesto de 200 µM dNTPoj kaj 0.2 µM enkondukoj rezultigas la atendatan 5 kb-produkton.
3.Eksonuclease-Agado:Kovado de 50 µl reago enhavanta minimumon de 12.5 U de Taq DNA Polymerase kun 10 nmol 5´-FAM-oligonukleotido dum 30 minutoj je 37℃ donas neniun konstateblan degeneron.
4.RNase-Agado:Kovado de 10 µL-reago enhavanta 20 U da enzimo kun 1μg da RNA-transskribaĵoj dum 2 horoj je 37 °C rezultigis neniun konstateblan degeneron de la RNA kiel determinite per ĝelelektroforezo.
5.Malaktivigo de Varmo:Ne.
Reagsistemo
| Komponentoj | Volumo |
| Ŝablono DNAa | nedeviga |
| 10 μM Antaŭen Enkonduko | 0,5 μL |
| 10 μM Reverse Primer | 0,5 μL |
| dNTP Miksaĵo (10 mM ĉiu) | 0,5 μL |
| 5×HC Taq Buffer | 5 μL |
| Taq DNA-polimerazob(5U/μL) | 0,125 μL |
| Sennukleaza akvo | Ĝis 25 μL |
Notoj:
1) a.
| DNA | Kvanto |
| Genomic | 1 ng-1 μg |
| Plasmido aŭ Viral | 1 pg-1 ng |
2) b.La optimuma koncentriĝo de Taq DNA Polymerase povas varii de 5-50 ekzempleroj/mL (0.1-0.5 ekzempleroj/25 µL reago) en specialecaj aplikoj.
Protokolo pri termika biciklado
PCR
| Paŝo | Temperaturo(°C) | Tempo | Cikloj |
| Komenca denaturadoa | 95 ℃ | 1-3 minutoj | - |
| Denaturado | 95 ℃ | 15-30 s | 30-35 Cikloj |
| Kolektib | 45-68 ℃ | 15-60 s | |
| Etendo | 68 ℃ | 1 kb/min | |
| Fina Etendo | 68 ℃ | 5 minutoj | - |
Notoj:
1) Komenca malnaturado de 1 min je 95 °C sufiĉas por plej multaj plifortigoj.Por malfacilaj ŝablonoj, pli longa denaturado de 2-3 minutoj je 95 °C estas rekomendita.Kun kolonia PCR, komenca 5-minuta denaturado je 95 °C estas rekomendita.
2) La kalcia paŝo estas tipe 15-60 s.Kuracia temperaturo estas bazita sur la Tm de la amorparo kaj estas tipe 45-68℃.
