Rnazo-inhibitoro
Murine RNase inhibitor estas rekombina murine RNase inhibitor esprimita kaj purigita de E.coli.Ĝi ligas al RNase A, B aŭ C en rilatumo 1:1 per ne-kovalenta ligo, tiel malhelpante la agadon de la tri enzimoj kaj protektante RNA de degenero.Tamen, Ĝi ne efikas kontraŭ RNase 1, RNase T1, S1 Nuclease, RNase H aŭ RNase de Aspergillus.Murina RNase-inhibitoro estis testita per RT-PCR, RT-qPCR kaj IVT mRNA, kaj estis kongrua kun diversaj komercaj Inversaj transkriptazoj, DNA-polimerazoj kaj RNA-polimerazoj.
Kompare al homaj RNase-inhibitoroj, murina RNase-inhibitoro ne enhavas du cisteinojn kiuj estas tre sentemaj al oksigenado kiu kaŭzas malaktivigon de la inhibitoro.Tio igante ĝin stabila ĉe malaltaj koncentriĝoj de DTT (malpli ol 1 mM).Ĉi tiu funkcio igas ĝin taŭga por uzo en reagoj kie altaj koncentriĝoj de DTT estas malfavoraj al la reago (ekz. Realtempa RT-PCR).
Aapliko
Ĉi tiu produkto povas esti vaste uzata en iu ajn eksperimento kie RNase-interfero eblas eviti RNA-degeneron, kiel ekzemple:
1.Sintezo de la unua fadeno de cDNA, RT-PCR, RT-qPCR, ktp.
2.Protektas RNA de degenero dum en vitro transskribo/tradukado (ekz., en vitro virusreplika sistemo).
3.Inhibicio de RNase-agado dum RNA-apartigo kaj purigo.
Kondiĉoj de Stokado
La produkto povas esti stokita je -25~- 15 ℃, valida dum 2 jaroj.
Stokado bufro
50 mM KCl, 20 mM HEPES-KOH (pH 7.6, 25 ℃), 8 mM DTT kaj 50% glicerolo.
Unuodifino
La kvanto de murina RNase-inhibitoro necesa por malhelpi la agadon de 5ng de ribonukleazo A je 50% estis difinita kiel unu unuo (U).
Molekula pezo de proteino
La molekulpezo de murina RNase-inhibitoro estas 50 kDa.
Kontrolo de kvalito
Eksonukleazo Aktiveco:
40 U da murina RNase-inhibitoro kun 1 μg λ -Hind III digesta DNA je 37℃ dum 16 horoj donas neniun degeneron kiel determinite per agarose-ĝela elektroforezo.
Endonukleaza Agado:
40 U da murina RNase-inhibitoro kun 1μ g λ DNA je 37 ℃ dum 16 horoj donas neniun degeneron kiel determinite per agaroza ĝela elektroforezo.
Nicking Aktiveco:
40U de murina RNase-inhibitoro kun 1μ g pBR322 je 37 ℃ dum 16 horoj donas neniun degeneron kiel determinite per agarosa ĝela elektroforezo.
RNazo Aktiveco:
40U de murina RNase-inhibitoro kun 1.6μ g MS2 RNA dum 4 h je 37 ℃ donas neniun degeneron kiel determinite per agarose-ĝela elektroforezo.
E.coli DNA:
40 U de murina RNase-inhibitoro estas ekzamenitaj por la ĉeesto de E. coli genomic DNA uzante TaqMan qPCR kun enkondukoj specifa por la E. coli 16S rRNA-lokuso.La E. coli genoma DNA-poluado estas ≤ 0.1 pg/40 U.
Notes
1.Perforta oscilado aŭ movo kondukos al enzima malaktivigo.
2.La optimuma temperaturo de ĉi tiu inhibitoro estis 25-55 ℃, kaj Ĝi estis senaktivigita je 65 ℃ kaj pli.
3.La agadoj de RNase H, RNase 1 kaj RNase T1 ne estis malhelpitaj de murina RNase-inhibitoro.
4.La inhibicio de RNase-agado estis trovita en larĝa gamo de pH (pH 5-9 estis ĉiuj aktivaj), kaj la plej alta agado estis observita ĉe pH 7-8.
5. Ĉar ribonukleazoj tipe konservas agadon sub denaturaj kondiĉoj, oni devas zorgi por eviti denaturajn molekulojn de RNase Inhibitor, kiuj kompleksiĝis kun ribonuclease.Por malhelpi la liberigon de aktiva ribonukleazo, temperaturoj pli grandaj ol 50 °C kaj altaj koncentriĝoj de ureo aŭ aliaj denaturaj agentoj devas esti evititaj.
