Uracil DNA Glikozilazo
Uracil-DNA Glycosylase (UNG aŭ UDG) estas rekombina klono de E.coli kun molekula pezo de 25 kDa.Ĝi katalizas la liberigon de libera uracilo de uracil-enhavanta unu-fadena kaj duoble-fadena DNA, kaj estas neaktiva kontraŭ RNA, kaj povas esti uzita por malhelpi poluadon de PCR-plifortproduktoj.La principo de ago baziĝas sur la fakto, ke se dUTP estas anstataŭigita per dTTP en la PCR-reago kaj formiĝas PCR-amplifiga produkto enhavanta dU-bazojn, la enzimo povas selekteme rompi la glikozidan ligon de U-bazoj en unu-fadenaj kaj duoble-fadenaj. DNA kaj degradi la PCR-plifortprodukton.
Rekomendita Apliko
Poluado Preventado Amplifiĝo
Kondiĉo de Stokado
-20 °C por longtempa konservado, devus esti bone miksita antaŭ uzo, evitu oftan frosto-degelon.
Stokado bufro
20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, Stabiligilo, 50% Glicerolo.
Unueca Difino
La kvanto de enzimo necesa por degradi 1µg da unu-fadena DNA enhavanta dU-bazojn en 1 horo je 37 °C estas 1 unuo.
Kontrolo de kvalito
1.SDS-PAGE elektroforeta pureco pli granda ol 98%
2.Plifortiga sentemo, batch-al-loka kontrolo, stabileco
3.Post kiam 1U de UNG estas traktita je 50 ℃ dum 2 minutoj, la ŝablono enhavanta U sub 103 kopioj devus esti tute degradita kaj neniu plifortiga produkto povas esti produktita.
4.Neniu eksogena nucleaza agado
Instrukcioj
| Komponentoj | Volumo (μL) | Fina koncentriĝo |
| 10 × PCR Buffer (dNTP senpaga, Mg²+senpaga) | 5 | 1× |
| dUTPoj (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (anstataŭigi dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0.25 | 1.25 U |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × Unua Miksaĵoa | 2 | 1× |
| Ŝablono | - | ＜1μg/reago |
| ddH₂O | Al 50 | - |
Notu: a: Se uzata por qPCR/qRT-PCR, la fluoreska sondilo devus esti aldonita en la reagsistemon.Kutime, fina primerkoncentriĝo de 0.2 μM povas doni bonajn rezultojn;kiam la reago agado estas malbona, la unua koncentriĝo povas esti ĝustigita en la gamo de 0.2-1 μM.Kutime, la sonda koncentriĝo estas optimumigita en la intervalo de 0.1-0.3 μM.Eksperimentoj pri koncentriĝgradiento povas esti faritaj por trovi la plej bonan kombinaĵon de enkonduko kaj sondilo.
Notoj
1.UNG-enzimo povas esti uzata por forigi la poluitajn dUTP-amplifigajn produktojn de la reagsistemo antaŭ la PCR-amplifiga reago, tiam por eviti malverajn pozitivajn rezultojn pro produkta poluado.
2.La optimuma temperaturo por UNG-enzimo por esti uzata en la kontraŭ-poluada PCR-reago estas ĝenerale 50 ℃ dum 2 minutoj;la malaktiviga kondiĉo estas 95℃ dum 5 minutoj.
3.Evitu oftan frosto-degelon, kaj ne eksponu al grandaj temperaturfluktuoj.
4.Malsamaj genoj ampligotaj havas malsaman utiligan efikecon de dUTP kaj sentemon al UNG-enzimo, tial, se la uzo de UNG-sistemo kondukas al malpliigo de detekta sentemo, la reagsistemo devas esti ĝustigita kaj optimumigita, se vi bezonas teknikan subtenon, bonvolu kontakti nia kompanio.
