Plantu rekta PCR-ilaro

Kato-N-ro: HCR2020A

Plant Direct PCR Kit taŭgas por rekta plifortigo de plantfolioj, semoj ktp., kaj povas esti uzata por altprodukta ekzamenado de plantspecimenoj, kiuj ne enhavas polisakaridojn kaj polifenolojn.La rekta plifortiga DNA-polimerazo bazita sur la direktita evoluo havas superan toleremon al PCR-inhibitoroj en plantoj.Dume, ĝi konservas la altan plifortigon, kiu taŭgas por plifortigo de DNA-fragmentoj ene de 5 kb.La unika Lysis-bufro A en la ilaro povas esti uzata por lizi freŝajn aŭ frostitajn plantajn histojn.Ĝi estas facile funkcii kaj la lisato povas esti uzata kiel ŝablono por plifortigo sen purigo.La sistemo enhavas protektajn agentojn kiuj ebligas krudajn specimenojn esti efike plifortigitaj post ripeta frostigado kaj degelo.2 × Plant Direct Master Mix nur bezonas aldoni enkondukojn kaj ŝablonojn por plenumi plifortigan reagon, tiel reduktante pipetajn operaciojn kaj plibonigante detektan trairon kaj reprodukteblecon de rezultoj.

Komponentoj

*Plant Direct Lysis Buffer B estas laŭvola reakciilo, kiu estas uzata por neŭtraligi Plant Direct Lysis Buffer A por plilongigi la stokadotempon de specimenoj.Ĝi povas esti uzata laŭ la reala situacio.

Kondiĉoj de Stokado

2 × Plant Rekta Majstra Miksaĵo, konservu ĉe -30 ~ -15 ℃ kaj evitu ripetan frostiĝon kaj degelon;Plantu Rekta Lysis Buffer, stoku je -30 ~ -15 ℃ aŭ 2 ~ 8 ℃.

Eksperimenta Procezo

Specimena Pretigo–Planto Folio

Rekta metodo:Oni rekomendas uzi junajn foliojn.Uzu truan truon kun fiksa diametro de 0,5 - 3 mm por akiri malgrandan kaj unuforman specimenon, kaj poste rekte aldonu la specimenon al la PCR-sistemo (50 μl-sistemo estas rekomendita).Notu, certigu, ke la specimeno estas en la PCR-solvo kaj ne kontraŭ la tubmuro.Se rekta PCR estas uzata por plifortigi longajn fragmentojn kaj kompleksajn specimenojn, uzi specimenon kun pli malgranda diametro (0,5 - 1 mm) kiel ŝablonon povas helpi akiri pli bonajn rezultojn.

Muelanta lizometodo:Oni rekomendas uzi junajn foliojn.Prenu malgrandan pecon da folio (ĉirkaŭ 1 – 3 mm en diametro), metu ĝin en 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab, kaj muelu ĝin kiel eble plej multe (ĉi tiu paŝo povas esti farita premante la folion per 100 μl pipetpinto). pigi la specimenon).Se pli grandaj volumoj de folia histo estas uzataj (ne superu 7 mm), pliigu la volumon de dilua bufro al 50 μl.Post kiam la folioj estas muelitaj, la solvo devus aperi verda.Post mallonga centrifugado, aldonu 1 μl de la supernatante al la PCR-sistemo kiel reagŝablono.

Metodo de termika lizo:Oni rekomendas uzi junajn foliojn.Prenu malgrandan pecon da folio (ĉirkaŭ 1 – 3 mm en diametro), metu ĝin en 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A, kaj varmigu ĝin je 95 ° C dum 5 – 10 min.La lizotempo povas esti taŭge plilongigita por folioj malfacile lizeblaj (ne pli ol 20 min).Se pli grandaj volumoj de folia histo estas uzataj (ne superu 7 mm), pliigu la volumon de dilua bufro al 50 μl.Post varmigado, centrifugu mallonge, kaj aldonu 1 μl da supernatante al la PCR-sistemo kiel reagŝablonob.

Specimena Pretigo– Plantu Semon

Muelanta lizometodo:Uzu skalpelon por tranĉi semojn kun diametro de 5 mm, aldonu ilin al 100 μl da Plant Direct Lysis Buffer A, kaj muelu la specimenon per pipetpinto aŭ aliaj iloj.Vortexu mallonge kaj lasu stari ĉe ĉambra temperaturo dum 3-5 minutoj.Certigu, ke la semprovaĵo estas mergita en la dilua bufro.Post mallonga centrifugado, aldonu 1 μl de la supernatante al la PCR-sistemo kiel reagŝablono.

Metodo de termika lizo:Uzu skalpelon por tranĉi semojn kun diametro de 5 mm, aldonu ilin al 100 μl da Plant Direct Lysis Buffer A, kaj varmigu je 95 °C dum 5 – 10 min.La lizotempo povas esti taŭge plilongigita por folioj malfacile lizeblaj (ne pli ol 30 min).Post varmigado, centrifugu mallonge, kaj aldonu 1 μl supernatante al la PCR-sistemo kiel reagŝablonob.

a.Tondiloj aŭ aliaj iloj ankaŭ povas esti uzataj por tranĉi specimenojn de taŭga grandeco;se la stampilo aŭ tondilo estas reuzataj, ili devas esti purigitaj per 2% natria hipoklorita solvo antaŭ ĉiu uzo por malhelpi kruc-poluadon inter specimenoj.

b.Certigu, ke la Plant Rekta Lysis Buffer estas plene fandita antaŭ uzo.Se la bufro estas viskoza aŭ havas precipitaĵojn, ĝi povas esti varmigita je 37℃ por plene fandi ĝin antaŭ uzo.

c.La volumo de ŝablono en la reagsistemo povas esti ĝustigita taŭge laŭ la diferenco en la volumeno de plantmaterialo kaj diluaĵo aldonita.

Planto Rekta Lysis Buffer

La Plant Rekta Liza Buffer A enhavita en ĉi tiu produkto estis strikte optimumigita por liberigi la genaron de la plej multaj plantaj histoj kaj taŭgas por mallongdaŭra stokado de krudaj plantoj je 4℃.Se la specimeno devas esti konservita dum pli longa tempo (ekz., 1-2 monatoj), oni rekomendas translokigi la supernatanton al nova EP-tubo kaj stoki ĝin je -20℃.Por konservi la specimenojn pli stabile, aldonu egalan volumenon de Plant Direct Lysis Buffer B al la transnatante transnadant, miksu bone kaj konservu je -20℃.La stabila stokado tempo varias laŭ plantprovaĵoj kaj statoj.

Reagsistemo

a.Ĝi enhavas Mg²⁺je fina koncentriĝo de 2 mM.

b.Oni rekomendas uzi finan koncentriĝon de 0.4μM por ĉiu enkonduko.Troa uzo de enkondukoj kondukos al pliigita nespecifa plifortigo.

c.La kvanto de specimeno uzata povas esti ĝustigita laŭ la reala situacio.La kvanto uzita en ununura reago de kruda lizita specimeno povas esti ĝustigita inter 2% - 20% de la totala volumeno de la reago.Uzi tro da specimenoj povas kaŭzi plifortigan fiaskon.

Programo de Reago

a.Komenca Denaturado (98℃, 5 min) antaŭenigas lizon de planthisto, liberigante genoman DNA kiu povas esti uzita por PCR-plifortigo.Ne mallongigu la tempon aŭ malpliigu la temperaturon.

b.Oni rekomendas agordi ĝin egala al la primer Tm-valoro aŭ 2 ~ 4℃ pli alta ol la Tm-valoro.La rekta plifortiga DNA-polimerazo uzata en ĉi tiu produkto diferencas de konvencia Taq DNA-polimerazo, kaj havas specialajn postulojn por la reakcia temperaturo; la uzo de alta kalcia temperaturo povas efike redukti nespecifan plifortigon kaj plibonigi la plifortigan efikecon.Por kompleksaj ŝablonoj, la efika plifortigo povas esti atingita per alĝustigo de kalcia temperaturo kaj plilongigante etendtempon.

c.Se la longo de la plifortiga produkto estas ≤1 kb, la etendtempo estas fiksita je 30 sek/kb;se la longo de la plifortiga produkto estas >1 kb, la etendtempo estas fiksita je 60 sek/kb.

d.Por kompleksaj provaĵoj aŭ specimenoj kun malalta plifortiga rendimento, la nombro da cikloj povas esti taŭge pliigita al 40 -50 cikloj.

Aplikoj

Ĝi estas aplikebla por rekta plifortigo de plantaj histoj kaj alt-trafia kribrado de plantprovaĵoj, kiuj ne enhavas polisakaridojn kaj polifenolojn.

Notoj

Nur por esploruzo.Ne por uzo en diagnozaj proceduroj.

1. Por kruda planta plifortigo aŭ rekta plifortigo, oni rekomendas uzi purigitan genoman DNA kiel pozitivan kontrolon antaŭ ol komenci la eksperimenton por certigi, ke la sistemo, enkondukoj kaj operacioj estas ĝustaj.

2. La rekta plifortiga DNA-polimerazo uzata en ĉi tiu ilaro havas fortan provlegadon.Se TA-klonado devas esti farita, estas rekomendite purigi la DNA antaŭ aldoni la adenino.

3. Unua Dezajna Gvidilo:

a.Oni rekomendas, ke la lasta bazo ĉe la 3′ fino de la enkonduko estu G aŭ C.

b.Sinsekvaj misagordoj devus esti evititaj en la lastaj 8 bazoj ĉe la 3′ fino de la enkonduko.c.Evitu harpinglaj strukturoj ĉe la 3′ fino de la enkonduko.

d.Diferencoj en la Tm-valoro de la antaŭa enkonduko kaj la inversa enkonduko devus esti ne pli ol 1℃ kaj la Tm-valoro devas esti alĝustigita al 60 ~ 72℃ (Primer Premier 5 rekomendas kalkuli la Tm-valoron).

e.Kromaj kromaj enkondukaj sekvencoj, kiuj ne kongruas kun la ŝablono, ne devus esti inkluditaj dum kalkulado de la enkonduka Tm-valoro.

f.Oni rekomendas, ke la enhavo de GC de la enkonduko estu 40% -60%.

g.La ĝenerala distribuo de A, G, C kaj T en la enkonduko devus esti kiel eble plej egala.Evitu uzi regionojn kun alta GC aŭ AT-enhavo.

h.Evitu la ĉeeston de komplementaj sekvencoj de 5 aŭ pli da bazoj aŭ ene de la enkonduko aŭ inter du enkondukoj kaj eviti la ĉeeston de komplementaj sekvencoj de 3 aŭ pli da bazoj ĉe la 3′ fino de du enkondukoj.

mi.Uzu la funkcion NCBI BLAST por kontroli la specifecon de la enkonduko por malhelpi nespecifan plifortigon.