RTL inversa transkriptazo
RTL inversa transkriptazo estas RNA ŝablon-dependa DNA-polimerazo al kiu mankas la 3'→5' eksonukleaza agado kaj havas RNase H agadon.Tiu enzimo povas utiligi RNA kiel ŝablonon por sintezi komplementan fadenon de DNA, kiu povas esti aplikita al unuafadena cDNA sintezo, precipe por RT-LAMPO (buklo-mediaciita izoterma plifortigo).Kompare kun RTL inversa transskribazo 1.0, la sentemo estas signife plibonigita, la termika stabileco estas pli forta, kaj la reago je 65 °C estas pli stabila.RTL inversa transkriptazo (sen glicerolo) povas esti uzata por prepari liofiligitajn preparojn, liofiligitajn RT-LAMP-reakcilojn ktp.
Unueca Difino
Unu unuo korpigas 1 nmol de dTTP en acid-precipiteblan materialon en 20 minutoj je 50°C uzante poli(A)•oligo(dT)25 kiel ŝablono-primo.
Komponentoj
| Komponanto | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL inversa transkriptazo (glicerol-libera) (15U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10×HC RTL Buffer | 1,5 ml | 4 × 1,5 ml | 5 × 10 ml |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 ml | 2 × 1,5 ml | 3 × 10 ml |
Kondiĉo de Stokado
Transportado sub 0 °C kaj stokita je -25 °C ~ -15 °C.
Kontrolo de kvalito
- Resta Agado deEdonukleazo:Reago de 50 μL enhavanta 1 μg de λDNA kaj 15 ekzemplerojn de RTL2.0 kovataj dum 16 horoj je 37 ℃ montras la saman ŝablonon kiel negativa kontrolo per ĝela elektroforezo.
- Resta Agado deEksonukleazo:Reago de 50 μL enhavanta 1 μg da Hind Ⅲ digestita λDNA kaj 15 ekzemplerojn de RTL2.0 kovataj dum 16 horoj je 37 ℃ montras saman ŝablonon kiel negativa kontrolo per ĝela elektroforezo.
- Resta Agado deNickase:Reago de 50 μL enhavanta 1 μg de supervolvita pBR322 kaj 15 ekzemplerojn de RTL2.0 kovataj dum 4 horoj je 37 °C montras saman ŝablonon kiel negativa kontrolo per ĝelelektroforezo.
- Resta Agado deRNazo:Reago de 10 μL enhavanta 0,48 μg de MS2 RNA kaj 15 ekzemplerojn de RTL2.0 kovataj dum 4 horoj je 37 °C montras saman ŝablonon kiel negativa kontrolo per ĝela elektroforezo.
- E. coli gDNA:Mezurita perE.colispecifaj HCD-detektaj iloj, 15 ekzempleroj de RTL2.0 enhavas malpli ol 1E. coligenaro.
Reago-Agordo
cDNA Sinteza Protokolo
| Komponentoj | Volumo |
| Ŝablono RNA a | nedeviga |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) aŭ Hazarda Primer-miksaĵo (60uM) | 2 μL |
| dNTP Miksaĵo (10 mM ĉiu) | 1 μL |
| RNazo-inhibitoro (40U/uL) | 0,5 μL |
| RTL Inversa Transkriptazo 2.0 (15U/uL) | 0,5 μL |
| 10×HC RTL Buffer | 2 μL |
| Sennukleaza Akvo | Ĝis 20 μL |
Notoj:
1) La rekomendita dozo de Totala RNA estas 1ng ~ 1μg
2) La rekomendita dozo de mRNA estis 50ng ~ 100ng
Termo-biciklado Kondiĉoj por rutino reago:
| Temperaturo (°C) | Tempo |
| 25 °Ca | 5 minutoj |
| 55 °C | 10 minutojb |
| 80 °C | 10 minutoj |
Notoj:
1) Se Hazarda Primer Miksaĵo estas uzata, inkubacio ĉe 25 °C.
2) Se oni uzas celan enkondukan miksaĵon, kovado paŝo je 55 °C dum 10 ~ 30 minutoj.
Protokolo RT-LAMP
| Komponentoj | Volumo | Fina Koncentriĝo |
| Ŝablono RNA | nedeviga | ≥10 kopioj |
| dNTP Miksaĵo (10mM) | 3,5 μL | 1,4 mM |
| FIP/BIP-Primoj (25×) | 1 μL | 1,6 μM |
| F3/B3 Enkondukoj (25×) | 1 μL | 0,2 μM |
| Enkondukoj LoopF/LoopB (25×) | 1 μL | 0,4 μM |
| RNazo-Inhibitoro (40U/μL) | 0,5 μL | 20 U/Reago |
| RTL Inversa Transkriptazo 2.0 (15U/μL) | 0,5 μL | 7.5 U/Reago |
| Bst V2 DNA-polimerazo (8U/μL) | 1 μL | 8 U/Reago |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 μL | 6 mM (Entute 8 mM) |
| 10×HC RTL-Bufro (aŭ 10×HC Bst V2-Bufro) | 2,5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| Sennukleaza Akvo | Ĝis 25 μL | - |
Notoj:
1) Miksu per vortexado kaj centrifugu mallonge por kolekti.Konstanta temperaturo kovado je 65 °C dum 1 horo.
2) La du bufroj estas kunfunkcieblaj kaj havas la saman konsiston.
Notoj
1.Ĉi tiu produkto formos blankan solidon kiam stokita je -20 °C.Elprenu ĝin de -20 °C kaj metu ĝin sur glacion dum ĉirkaŭ 10 minutoj.Post fandado, ĝi povas esti uzata per skuado kaj miksado.
2.La cDNA-produkto povus esti stokita ĉe -20 °C aŭ -80 °C aŭ uzata tuj por PCR-reago.
3.Por malhelpi RNase-poluadon, bonvolu konservi la eksperimentan areon pura, kaj porti purajn gantojn kaj maskojn dum operacio.
