M-MLV Neoscript Reverse Transcriptase
Neoscript Reverse Transcriptase estas inversa transkriptazo akirita per mutaciorastrumo de la M-MLV-geno de Moloney murine leŭkemia viruso origino kaj esprimo en E.coli.La enzimo forigas RNase H-agadon, havas pli altan temperaturtoleremon, kaj taŭgas por alt-temperatura inversa transskribo.Tial, ĝi estas helpema por elimini la malfavorajn efikojn de la RNA altnivela strukturo kaj nespecifaj faktoroj sur cDNA-sintezo, kaj havas pli altan stabilecon kaj inversan transskriban sintezkapablon.La enzimo havas pli altan stabilecon kaj inversan transskriban sintezkapablon.
Komponentoj
1.200 U/μL Neoscript Reverse Transcriptase
2.5 × Unua Fadena Bufro (laŭvola)
* 5 × First-Strand Buffer ne enhavas dNTP, bonvolu aldoni dNTP-ojn kiam vi preparas la reagsistemon
Rekomendita Apliko
1.Unu-paŝa qRT-PCR.
2.Detekto de RNA-viruso.
Kondiĉo de Stokado
-20 °C por longtempa konservado, devus esti bone miksita antaŭ uzo, evitu oftan frosto-degelon.
Unueca Difino
Unu unuo asimilas 1 nmol da dTTP en 10 minutoj je 37 °C uzante poli(A)•oligo(dT)25kiel ŝablono/primo.
Kontrolo de kvalito
1.SDS-PAGE elektroforetika pureco pli granda ol 98%.
2.Plifortiga sentemo, bat-al-loka kontrolo, stabileco.
3.Neniu eksogena nukleaza agado, neniu eksogena endonukleazo aŭ eksogena nukleazo poluado
Reago-Agordo por Unua Ĉenreaga Solvo
1.Preparado de la reakcia miksaĵo
| Komponentoj | Volumo |
| Oligo (dT)12-18 Primer aŭ Random Primera Aŭ Gene Specific Primersb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| Ŝablono RNA | Tuta RNA≤ 5μg;mRNA≤ 1 μg |
| RNazo-libera dH2O | Al 10 μL |
Notoj:a/b: Bonvolu elekti malsamajn specojn de enkondukoj laŭ viaj eksperimentaj bezonoj.
2.Varmigu je 65 °C dum 5 minutoj kaj malvarmigu rapide sur glacio dum 2 minutoj.
3.Aldonu la sekvajn komponentojn al ĉi-supra sistemo al totala volumeno de 20µL kaj miksu milde:
| Komponentoj | Volumo (μL) |
| 5 × Unua-Strand Buffer | 4 |
| Neoscript Inversa Transskribazo (200 U/μL) | 1 |
| RNase-inhibitoro (40 U/μL) | 1 |
| RNazo-libera dH2O | Al 20 μL |
4.Bonvolu plenumi la reagon laŭ la sekvaj kondiĉoj:
(1) Se Hazarda Primero estas uzata, la reago devas esti farita je 25 ℃ dum 10 minutoj, kaj poste je 50 ℃ dum 30 ~ 60 minutoj;
(2) Se estas uzataj Oligo dT aŭ specifaj enkondukoj, la reago devas esti farita je 50 ℃ dum 30 ~ 60 minutoj.
5.Varmigu je 95 ℃ dum 5 minutoj por malaktivigi Neoscript Reverse Transcriptase kaj ĉesigi la reagon.
6.Inversa transskribaj produktoj povas esti uzataj rekte en PCR-reago kaj fluoreskeca kvanta PCR-reago, aŭ konservitaj ĉe -20℃ dum longa tempo.
PCR Rago:
1.Preparado de la reakcia miksaĵo
| Komponentoj | Koncentriĝo |
| 10 × PCR Buffer (dNTP senpaga, Mg²+ senpaga) | 1× |
| dNTP-oj (10 mM ĉiu dNTP) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq DNA-polimerazo (5U/μL) | 2-2,5 U |
| Enkonduko 1 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Enkonduko 2 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Ŝablonoa | ≤10% Solvo pri Unua Ĉena Reakcio (2 μL) |
| ddH2O | Al 50 μL |
Notoj:a: Se aldonas tro multe da unua ĉenreaga solvo, la PCR-reago povas esti malhelpita.
2.PCR-Reago-Procedo
| Paŝo | Temperaturo | Tempo | Cikloj |
| Antaŭ-malnaturado | 95℃ | 2-5 minutoj | 1 |
| Denaturado | 95℃ | 10-20 sek | 30-40 |
| Kolekti | 50-60℃ | 10-30 sek | |
| Etendo | 72℃ | 10-60 sek |
Notoj
1.Taŭga por inversa transskriba temperaturo-optimumigo en la gamo de 42 ℃ ~ 55 ℃.
2.Ĝi havas pli bonan stabilecon, taŭgas por plifortigo de inversa transskribo de alta temperaturo.Krome, ĝi estas favora por efike trapasi kompleksajn strukturajn regionojn de RNA.Ankaŭ, ĝitaŭgas por unupaŝa plureksa fluoreskeca kvanta RT-PCR-detekto.
3.Bona kongruo kun diversaj PCR-amplifigaj enzimoj kaj taŭgas por RT-PCR-reagoj de alta sentemo.
4.Taŭga por alta sentiveca unupaŝa fluoreskeca kvanta RT-PCR-reago, efike plibonigas la detektan indicon de malalta koncentriĝo de ŝablonoj.
5.Taŭga por cDNA biblioteko konstruo.
