EndoFree Plasmid Maxi Kit
Ĉi tiu ilaro taŭgas por eltiro de 150 - 300 ml da bakteria solvaĵo kulturita dum la nokto, uzante plibonigitan SDS-alkalan lizmetodon por lizi la bakteriojn.La kruda ekstrakto estas selekteme kombinita kun unika Endotoxin Scavenger kaj apartigita per centrifugado por forigi endotoksinojn.Tiam, la silika ĝelmembrano selekteme ligas al plasmida DNA en la solvaĵo sub kondiĉoj de alta salo kaj malalta pH.Ĉi tio estas sekvita per aldono de lavbufro por forigi malpuraĵojn kaj aliajn bakteriajn komponentojn.Finfine, malalt-salo, alt-pH-livbufro kutimas eligi puran plasmidDNA de la silicia matricomembrano.La silika ĝela membrano uzas specialan adsorban membranon, kaj la adsorba kvanto-diferenco inter la kolumno kaj la kolumno estas tre malgranda kaj la ripetebleco estas bona.Fenolo, kloroformo kaj aliaj toksaj reakciiloj ne estas postulataj, kaj ankaŭ ne estas etanolaj precipitaj paŝoj.Ĉi tiu ilaro povas esti uzata por rapide ĉerpi 0,2 -1,5 mg da pura altkopia plasmida DNA, kun ekstraktado de 80% -90%.La ilaro uzas unikan procezan formulon forigas endotoksinon, la enhavo de endotoksino estas ekstreme malalta kaj la ĉela transfekta efiko estas bonega.La ĉerpita plasmido povus esti rekte uzata en enzimdigestado, PCR, en vitro transskribo, transformo, sekvencado kaj aliaj molekula biologiaj eksperimentoj.
Kondiĉoj de konservado
RNaseA devas esti stokita je -30 ~ -15℃ kaj transportita je ≤0℃.
Endotoxin Scavenger povas esti stokita je 2 ~ 8 ℃ dum unu monato, stokita je -30 ~ -15 ℃ por longdaŭra stokado.kaj transportita je ≤0℃.
Aliaj komponantoj devas esti stokitaj ĉe ĉambra temperaturo (15 ~ 25 ℃) kaj transportitaj ĉe ĉambra temperaturo.
Komponentoj
| Komponentoj | 10RXNS |
| RNase A | 750 μL |
| Bufro P1 | 75 ml |
| Bufro P2 | 75 ml |
| Bufro P4 | 75 ml |
| Endotoksinkaŝkaptisto | 25 ml |
| Buffer PW | 2 × 22 ml |
| Buffer TB | 20 ml |
| FastPure DNA-Maksiaj Kolumnoj (Ĉiu en Kolekta Tubo de 50ml) | 10 |
| Endotoxin-libera Kolekta Tubo | 2 × 5 |
RNaseA:10 mg/ml, uzata por forigi RNA.
Bufro P1:bakteria suspenda bufro, aldonu RNaseA al Buffer P1 antaŭ la unua uzo.
Bufro P2:bakteria lizobufro (enhavanta SDS/NaOH).
Bufro P4:neŭtraliga bufro.
Endotoksin Scavenger:efike forigi endotoksinon de la kruda plasmid ekstrakto.
Bufro PW:lavu bufron, aldonu la kondiĉitan volumon de etanolo antaŭ la unua uzo.
Bufro TB:elucia bufro.
FastPure DNA-Maksiaj Kolumnoj:plasmida DNA-adsorbadkolonoj.
Kolektaj Tuboj 50 ml:filtraj kolektotuboj.
Kolekta Tubo sen endotoksinoj:plasmida DNA-kolektaj tuboj.
Pretaj Materialoj
Absoluta etanolo, izopropanolo, 50 ml rondfundaj centrifugiltuboj kaj 50 ml sen endotoksinojcentrifugaj tuboj.
Aplikoj
Ĉi tiu produkto taŭgas por grandskala eltiro de plasmidoj de 150 - 300 ml da bakteria solvo.kulturita dum la nokto.
Eksperimenta Procezo
1. Prenu 150 – 200 ml (ne pli ol 300 ml) da bakteria solvaĵo kulturita dum la nokto kaj centrifugu jeproksimume 11,000 rpm (12,000 × g) dum 1 – 2 min.Forĵetu la supernatante kaj kolektu bakteriojn.
Δ Kiam oni kolektas pli ol 50 ml da bakteria solvaĵo, la bakterioj povas esti kolektitaj aldonante bakterian solvon, centrifugadon, forĵetante la supernatanton kaj aliajn paŝojn en la sama tubo de 50 ml por
plurfoje.
2. Aldonu 7,5 ml da Buffer P1 (bonvolu kontroli ĉu RNaseA estis aldonita al Buffer P1) al la centrifugilotubo enhavanta bakteriojn kaj miksi plene per vortico aŭ pipetaĵo.
Δ La kompleta resuspendado de bakterioj en ĉi tiu paŝo estas kritika por cedi, kaj ne devus ekzisti bakteriaj amasoj post resuspendado.Se ekzistas bakteriaj amasoj ne plene miksitaj, ĝi influos la lizon, rezultigante malaltan rendimenton kaj purecon.Se la OD600 de bakteria solvaĵo estas 0,65, oni rekomendas uzi 7,5 ml da Buffer P1 kiam oni eltiras el 150 ml da bakteria solvaĵo;kiam OD600 estas 0,75, 8 ml de Buffer P1 devus esti uzataj kaj la volumoj de Buffers P2 kaj P4 devus esti ŝanĝitaj laŭe.Se la volumeno de la bakteria solvo pliiĝas al 200 ml, oni rekomendas ke lavolumeno de Bufferoj P1, P2, kaj P4 estu proporcie pliigita.
3. Aldonu 7,5 ml da Buffer P2 al la bakteria suspendo de la paŝo 2 kaj miksu milde supren kaj malsupren dum 6 – 8fojojn kaj kovu ĉe ĉambra temperaturo dum 4-5 minutoj.
Δ Inversu milde por miksi ĝisfunde.Vortico kaŭzos la genoman DNA-fragmentiĝon, rezultigante genomajn DNA-fragmentojn en la eltirita plasmido.Ĉe tiu tempo, la solvo iĝas viskoza kaj diafana, montrante ke la bakterioj estis plene lizitaj.La daŭro ne devus superi 5 minutojn por eviti detruon de la plasmidoj.Se la solvo ne estas klara, povas rezulti tro da bakteriojnekompleta lizo, do la kvanto de bakterioj devus esti reduktita taŭge.
4. Aldonu 7,5 ml da Buffer P4 al la bakteria suspendo de la paŝo 3 kaj tuj renversu milde 6 – 8 fojojn por permesi al la solvo tute neŭtraligi Buffer P2.Ĉi-momente, blanka flokula precipitaĵo devus aperi.Centrifugu je pli ol ĉirkaŭ 11 000 rpm (12 000 × g) dum 10 – 15 min, zorge pipitu la supernatanton en novan rondfundan centrifugilon de 50 ml (mempreparitan), kaj evitu.aspiru la flosantan blankan precipitaĵon.
Δ Aldonu Buffer P4 kaj tuj renversu por bone miksi.Lasu la tubon stari ĝis la blanka precipitaĵo estas distribuita egale tra la solvo por malhelpi la produktadon de loka precipitaĵo, kiu povus influi neŭtraligon.Se ne estas unuforma blanka flokula precipitaĵo antaŭ centrifugado kaj la supernatante ne estas klara post centrifugado, la tubo povas esticentrifugata dum aliaj 5 minutoj.
5. Aldonu 0. 1 fojojn la volumenon (10% de la supernatant volumeno, ĉirkaŭ 2.2 ml) de Endotoxin Scavenger al la supernatant de paŝo 4 kaj inversigi al miksi.Metu la solvon en glacibanon aŭ enmetu en disbatitan glacion (aŭ fridujon frostujon) dum 5 minutoj ĝis la solvo ŝanĝiĝas de malklara al klara kaj travidebla (aŭ ankoraŭ.iomete malklara), kaj foje miksi plurfoje.
Δ Post kiam la Endotoksinkaŝkaptisto estas aldonita al la supernadantaĵo, la supernadantiĝos malklara sed lasupernatante devus fariĝi klara (aŭ iomete malklara) post malvarmigo en la glacia bano.
6. Post kiam la supernatante estas metita ĉe ĉambra temperaturo (>25℃) dum 10 – 15 min, ĝi fariĝos malklara kielĝia temperaturo pliiĝas al ĉambra temperaturo.Tiam la supernatanto devus esti inversigita por miksi.
Δ Se ĉambra temperaturo estas pli malalta aŭ vi volas redukti eltiran tempon, la supernatante povas esti kovata en 37 ~ 42 ℃ akvobanon dum 5 - 10 minutoj kaj la sekva paŝo povas esti farita post la supernatante.fariĝas malklara.
7. Centrifugu la supernatante je ĉirkaŭ 11 000 rpm (12 000 × g) dum 10 min ĉe ĉambra temperaturo (temperaturo devas esti >25 ℃) por apartigi la fazon.La supra akva fazo enhavas la DNA dum la pli malalta blua olea faztavolo enhavas endotoksinon kaj aliajn malpuraĵojn.Transloku laDNA-entenanta akva fazo al nova tubo kajforĵeti la olean tavolon.
Δ La temperaturo dum centrifugado devas esti pli ol 25 ℃ kiel efektiva faza apartigo neokazas se la temperaturo estas tro malalta.
Δ Se la faza apartigo ne efikas, la centrifuga temperaturo povas esti ĝustigita al 30℃ kajla tempo de centrifugado povas esti pliigita al 15 min.
Δ Ne suĉu la bluan olean tavolon ĉar ĝi enhavas endotoksinon kaj aliajn malpuraĵojn.
Mekanismo
Resuspension Lysis Neutralization
◇ Aldonu 7,5 ml Buffer P1
◇ Aldonu 7,5 ml Buffer P2
◇ Aldonu 7,5 ml Buffer P4
Forigo de endotoksinoj
◇Aldonu 0. 1 fojojn la supernatantan volumon de Endotoxin Scavenger
Bindado kaj Lavado
◇ Aldonu 0,5 fojojn la volumenon de izopropanolo
◇ Aldonu 10 ml Buffer PW
◇ Aldonu 10 ml Buffer PW
Elucio
◇ Aldonu 1 – 2 ml Buffer TB aŭ Endotoxin-libera ddH2O
