DNA Eltiro Mini Kit
Ĉi tiu ilaro adoptas optimumigitan bufran sistemon kaj silika ĝelan kolumnan purigan teknologion, kiuj povas reakiri 70 bp - 20 kb DNA-fragmentojn de diversaj koncentriĝoj de TAE aŭ TBE-agarose-ĝelo.DNA-adsorba kolumno povas speciale adsorbi DNA sub alta sala kondiĉo.Krome, la ilaro povas rekte purigi DNA-fragmentojn de PCR-produktoj, enzimecaj reakciaj sistemoj aŭ krudaj DNA-produktoj akiritaj per aliaj metodoj, kaj forigi malpuraĵojn kiel proteinoj, aliaj organikaj komponaĵoj, neorganikaj salaj jonoj kaj oligonukleotidaj enkondukoj.Ĝi povas certigi, ke la purigo povas esti finita ene de 10-15 minutoj.La purigita DNA povas esti uzata rekte por ligado, transformo, enzimdigestado, in vitro transskribo, PCR, sekvencado, mikroinjekto ktp.
Kondiĉoj de konservado
Konservu je -15 ~ -25℃ kaj transportu ĉe ĉambra temperaturo.
Komponentoj
| Komponentoj | (100 rxns) |
| Buffer MEP | 80 ml |
| Buffer GW | 2 × 20 ml |
| Elucia Bufro | 20 ml |
| FastPure DNA-Miniaj Kolumnoj-G | 100 |
Bufro MEP:DNA-liga bufro.
Bufro GW:Lava bufro;aldonu absolutan etanolon per la indikita volumeno sur la botelo antaŭ uzo.
Elucia bufro:Elucio.
FastPure DNA-Miniaj Kolumnoj-G:DNA-adsorbaj kolumnoj.
Kolektaj Tuboj 2 ml:Kolektaj tuboj por filtrito.
Pretaj Materialoj
1,5 ml steriligitaj tuboj, absoluta etanolo kaj izopropanolo (kiam DNA fragmento ≤100 bp, aldonu 1 volumon
izopropanolo al 1 volumena ĝelo), akvobano.
Eksperimenta Procezo
Aldonu 80 ml da etanolo por dilui Buffer GW kiel indikite sur la etikedo antaŭ uzo, konservu ĉe ĉambra temperaturo.
Mekanismo
1. PCR-reaga solvo
Ĝelo-ekstrakta skemo: Aldonu egalan voluman Buffer GDP PCR-reakcian solvoskemon:Aldonu 5 fojojn la volumo Buffer
2. MEP Kalkulu la volumenon de ĝelo (100 μl egalas 100 mg)
Solvu ĝelon
3. Antaŭvarmigu je 50 ~ 55℃
4. Bind Wash
Aldonu 300 μL da Buffer GDP*
Aldonu 700 μL da Buffer GW
Aldonu 700 μL da Buffer GW
5. Eluti
Aldonu 20 - 30μL de Elution Buffer aŭ dejonigitan akvon
Notoj* PCR-reaga fluida reakiro sen ĉi tiu paŝo
Programo por eltiro de ĝelo
1. Post DNA-elektroforezo por frakciado de DNA-fragmentoj, detranĉu la ununuran strion de DNA-fragmento el la agarosa ĝelo sub UV-lumo.Oni rekomendas uzi sorban paperon por sorbi ŝajnan humidon de ĝelo kaj minimumigi la grandecon de la ĝela tranĉaĵo forigante kroman agarozon kiel eble plej eble.Pezu la ĝeltranĉaĵon (sen mikrocentrifuga tubo) por kalkuli ĝian volumenon: La volumeno de 100 mg ĝeltranĉaĵo estas proksimume 100 μL, supozante ke la denseco estas 1g/ml.
2. Aldonu egalan volumon Buffer GDP, kovu je 50 ~ 55 ℃ dum 7-10 min (laŭ la ĝela grandeco, ĝustigu la inkubacion ĝis la ĝelo tute dissolviĝos).Turnu la tubon 2 fojojn dum la kovado.
Δ Aldono de 1-3 volumoj de Buffer GDP ne influos DNA-reakira efikecon.Se la DNA-fragmento esti reakirita <100 bp, 3 volumoj de Buffer GDP devas esti aldonitaj;kiam la ĝela tranĉaĵo tute dissolviĝis, aldonu 1 volumon da izopropanolo kaj miksu plene, poste daŭrigu al la sekva paŝo.
3. Centrifugu mallonge por alporti la specimenon al la fundo de la tubo, enigu la FastPure DNA Mini Columns-G en la Kolektajn Tubojn 2 ml, zorge transigu la solvon maksimume de 700 μL unufoje po.
tempo al la filtraj kolonoj, centrifugu je 12,000 rpm (13,800 X g) dum 30-60 sek.
4. Forĵetu la filtriton kaj aldonu 300 μL da Buffer GDP al la kolumno, kovu ĉe ĉambra temperaturo dum 1 min, centrifugu je 12 000 rpm (13 800 X g) dum 30-60 sek.
5. Forĵetu la filtriton kaj aldonu 700 μL da Buffer GW (kontrolu ĉu absoluta etanolo estis aldonita anticipe!) al la kolono, centrifugu je 12,000 rpm (13,800 X g) dum 30-60 sek.
Δ Bonvolu aldoni Buffer GW ĉirkaŭ la adsorba kolumna muro, aŭ aldoni Buffer GW-malantaŭan kovrilon kaj miksi ĝin renverse por 2 - 3 fojojn por helpi tute flui la salon aliĝantan al la tubmuro.
6. Ripetu paŝon 5.
Δ Flushing kun Buffer GW dufoje povas certigi, ke la salo estas tute forigita kaj forigi la efikon al postaj eksperimentoj.
7. Forĵetu la filtriton kaj centrifugu la malplenan kolonon je 12.000 rpm (13.800 X g) dum 2 min.
8. Enmetu la kolumnon en puran 1,5 ml mikrocentrifugan tubon, aldonu 20 - 30 μL de Elution Buffer al la centro de la kolumna membrano, kovu dum 2 min, kaj poste centrifugu je 12 000 rpm (13 800 X g) dum 1 min.Forĵetu la kolumnon, konservu la akiritan DNA ĉe -20 .
Δ Transdono de la supernatante de paŝo 8 al la kolono por denove elui kaj antaŭvarmigi la Elution Buffer al 55 (kiam DNA-fragmento > 3 kb) eble helpe pliigi la reakivan efikecon.
Programo de reakiro de PCR-produktoj
Ĉi tiu protokolo estas aplikebla por purigi DNA-fragmentojn de PCR-produktoj, enzimeca reagsistemo kaj aliaj DNA-krudaj produktoj (inkluzive de genetika DNA).Ĉi tiu solvo povas efike forigi diversajn nukleotidojn, primerojn, primerdimerojn, salmolekulojn, enzimojn kaj aliajn malpuraĵojn.
1. Mallonge centrifugu PCR-produktojn, enzimecan reakcian solvon kaj aliajn DNA-krudajn produktojn.Taksi ilian volumon per pipeto kaj transdonu al steriligita 1,5 ml aŭ 2 ml tubo.Aldonu ddH2O ĝis la volumo ĝis 100 μL;dum por genoma DNA kun alta koncentriĝo, dilui al 300 μL kun ddH2O helpos plibonigi reakivan efikecon.
2. Aldonu 5 volumojn de Buffer GDP, miksu ĝisfunde renversante aŭ vortexante.Se interesa fragmento de DNA >100 bp, necesas aldoni pliajn 1,5 volumojn (provaĵoj + Buffer MEP) de etanolo.
3. Enmetu la kolumnon reen en la kolektan tubon, transdonu la miksaĵon al la kolumno, centrifugu je 12 000 rpm (13 800 ×g) dum 30 – 60 sek.Se la volumeno de la miksita solvaĵo estas >700 µL, remetu la adsorban kolumnon en la kolektan tubon, transdonu la restantan solvon al la adsorban kolumnon kaj centrifugu je 12,000 rpm (13,800 × g) dum 30 – 60 sek.
4. La sekva agado rilatas al la paŝo 5 – 8 de 08- 1/Gel-eltira programo.
Aplikoj
Diversaj koncentriĝoj de TAE aŭ TBE agarose-ĝelo;PCR-produktoj, enzimecaj reagsistemoj aŭ aliaj krudaj DNA-produktoj akiritaj per diversaj metodoj.Reakiritaj fragmentoj variis de70 bp -20 kb.
Notoj
Nur por esploruzo.Ne por uzo en diagnozaj proceduroj.
1. Aldonu 80 ml da etanolo por dilui Buffer GW kiel indikite sur etikedo antaŭ uzo, konservu ĉe ĉambra temperaturo.
2. Se la Buffer GDP estas facile falebla dum malalta temperaturo, ĝi povas esti metita ĉe ĉambra temperaturo dum tempodaŭro antaŭ uzo.Se necese, ĝi povas esti antaŭvarmigita en akvobano je 37℃ ĝis la precipitaĵo estas tute solvita, kaj tiam ĝi povas esti uzata post miksado.
3. Antaŭe starigu la akvobanan temperaturon al 50 ~ 55℃.
4. En 08-1/Gel-eltira programo paŝo 1, minimumigi la grandecon de ĝela tranĉaĵo signife reduktos la solvadan tempon kaj pliigas reakivan efikecon (Linearigita DNA estas facile hidrolizebla kiam kontinue elmontrita ĉe alta temperaturo).Ne elmontru DNA-ĝelon al UV dum longa tempo, ĉar transviola lumo povas kaŭzi DNA-damaĝon.
5. Solvu la ĝelon en 08- 1/Gel-eltira programo paŝo 2 tute, alie la efikeco de reakiro de DNA estos grave tuŝita.
6. Antaŭvarmigu Elution Buffer aŭ ddH2O al 55℃, kio estas helpema por plibonigi DNA-elucian efikecon.Oni rekomendas konservi DNA en eluento de 2.5 mM Tris-HCl, pH 7.0 - 8.5.
