Vaccinia Virus-Ĉapa Enzimo

Vaccinia virus-kapa enzimo estas derivita de rekombina E. coli-trostreĉiĝo portas la genojn por la Vaccinia-kapa enzimo.Tiu ununura enzimo estas kunmetita de du subunuoj (D1 kaj D12) kaj havas tri enzimecajn agadojn (RNA-trifosfatazo kaj guanililtransferazo de la D1-subunuo kaj guaninmetiltransferazo de la D12-subunuo).Vaccinia viruso Capping Enzyme estas efika por katalizi la formadon de ĉapostrukturo, kiu povas specife alkroĉi la 7-metilguanilata ĉapstrukturon (m7Gppp, Cap 0) al la 5′ fino de RNA.Kapstrukturo (Ĉapo 0) ludas gravan rolon en mRNA-stabiligo, transporto kaj traduko en eŭkariotoj.Kapti RNA per enzimeca reago estas efika kaj simpla metodo kiu povas signife plibonigi la stabilecon kaj tradukon de RNA por en vitro transskribo, transfekto, kaj mikroinjekto.

Komponentoj

Vaccinia Virus-Kapa Enzimo (10 U/μL)

10×Lima Bufro

Kondiĉoj de konservado

-25～- 15℃ por stokado (Evitu ripetajn frostig-degeliĝojn)

Stokado bufro

20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,

1mM DTT, 0. 1mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% glicerolo.

Unueca Difino

Unu unuo de Vaccinia viruso Capping Enzyme estas difinita kiel la kvanto de enzimo necesa por korpigi 10pmol da GTP en 80nt transskribaĵon en 1 horo je 37 °C.

Kontrolo de kvalito

Eksonukleazo:10U de Vaccinia viruso Capping Enzyme kun 1μg λ-Hind III digesta DNA je 37 ℃ dum 16 horoj donas neniun degeneron kiel determinite per agarose-ĝela elektroforezo.

Endonukleazo:10U de Vaccinia viruso Kapa Enzimo kun 1μg λDNA je 37 ℃ dum 16 horoj donas neniun degeneron kiel determinite per agarose-ĝela elektroforezo.

Nickase:10U de Vaccinia viruso Capping Enzyme kun 1 μg pBR322 je 37 ℃ dum 16 horoj donas neniun degeneron kiel determinite per agarose-ĝela elektroforezo.

RNazo:10U de Vaccinia viruso Kaptiga Enzimo kun 1.6μg MS2 RNA dum 4 horoj je 37℃ donas neniun degeneron kiel determinite per agarosa ĝela elektroforezo.

1.coli DNA:10U de Vaccinia viruso Capping Enzyme estas ekzamenita por la ĉeesto de E. coli genomic DNA uzante TaqMan qPCR kun enkondukoj specifa por la E. coli 16S rRNA-lokuso.La E. coli genoma DNA-poluado estas≤1 E. coli genaro.

2.Bakteria Endotoksino: LAL-testo, laŭ Ĉina Farmakopeo IV 2020 eldono, ĝela limo-testmetodo, ĝenerala regulo (1143).La enhavo de bakteria endotoksino devas esti ≤10 EU/mg.

Reagsistemo kaj kondiĉoj

1. Kapa Protokolo (reaga volumo: 20 μL)

Ĉi tiu proceduro estas aplikebla al la ĉapa reago de 10μg RNA (≥100 nt) kaj ĝi povas esti pligrandigita laŭ eksperimentaj postuloj.

I) Kombinu 10μg RNA kaj Nuclease-libera H2O en 1.5 ml mikrofuge tubo al fina volumeno de 15.0 μL.*10×Kapping Buffer: 0.5M Tris-HCl, 50mM KCl, 10mM MgCl2, 10mM DTT, (25℃, pH 8.0)

2) Varmigu je 65 ℃ dum 5 minutoj kaj poste glacia bano dum 5 minutoj.

3) Aldonu la sekvajn komponantojn en la specifita ordo

*10×Kapping Buffer: 0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH8.0)

4) Kovu je 37 °C dum 30 minutoj, RNA nun estas kovrita kaj preta por kontraŭfluaj aplikoj.

2. 5′ terminalo etikedreago (reaga volumo: 20 μL)

Ĉi tiu protokolo estas dizajnita por etikedi RNA enhavantan 5´ trifosfaton kaj ĝi povas esti pligrandigita laŭ postuloj.La efikeco de etikedo enkorpiĝo estos influita de la molara rilatumo de RNA: GTP, same kiel la GTP-enhavo en RNA-provaĵoj.

1) Kombinu taŭgan kvanton de RNA kaj sennukleazo H2O en 1.5 ml mikrofuge tubo al fina volumeno de 14.0 µL.

2) Varmigu je 65 ℃ dum 5 minutoj kaj poste glacia bano dum 5 minutoj.

3) Aldonu la sekvajn komponantojn en la specifita ordo.

** GTP MIX rilatas al GTP kaj malgranda nombro da markiloj.Por la koncentriĝo de GTP, konsultual Noto 3.

4) Kovu je 37 °C dum 30 minutoj, RNA 5′-fino nun estas etikedita kaj preta por kontraŭflue

Aplikoj

1. Kapado de mRNA antaŭ tradukaj analizoj/in vitro traduko

2. Etikedado 5´ fino de mRNA

Notoj pri uzo

1.Varmigi la solvon de RNA antaŭ kovado kun la Vaccinia Kapa Enzimo forigas sekundaran strukturon ĉe la 5'fino de la transskribaĵo.Plilongigi tempon al 60 minutoj por transskribaĵoj kun konataj tre strukturitaj 5'finaĵoj.

2. RNA uzata por kovri reagojn devas esti purigita antaŭ uzo kaj suspendita en sennukleaza akvo.EDTA ne devus ĉeesti kaj la solvo devus esti libera de saloj.

3. Por etikedi la 5´-finon, la totala GTP-koncentriĝo devus esti proksimume 1-3 fojojn la molara koncentriĝo de mRNA en la reago.

4. La volumo de la reagsistemo povas esti skalita supren aŭ malsupren laŭ la reala.