PNGase F
Peptide-N-Glycosidase F (PNGase F) estas la plej efika enzimeca metodo por forigi preskaŭ ĉiujn N-ligitajn oligosakaridojn de glikoproteinoj.PNGase F estas amidazo, kiu fendetiĝas inter la plej internaj GlcNAc kaj asparaginrestaĵoj de alta manozo, hibrido, kaj kompleksaj oligosakaridoj de N-ligitaj glikoproteinoj.
Apliko
Ĉi tiu enzimo estas utila por forigo de karbonhidrataj restaĵoj el proteinoj.
Preparo kaj specifo
| Aspekto | Senkolora Likvaĵo |
| Proteina pureco | ≥95% (de SDS-PAGE) |
| Aktiveco | ≥500,000 U/mL |
| Eksoglikozidazo | Neniu agado povus esti detektita (ND) |
| Endoglikozidazo F1 | ND |
| Endoglikozidazo F2 | ND |
| Endoglikozidazo F3 | ND |
| Endoglikozidazo H | ND |
| Proteazo | ND |
Propraĵoj
| EC-numero | 3.5.1.52(Rekombina el mikroorganismo) |
| Molekula pezo | 35 kDa (SDS-PAĜO) |
| Izoelektra punkto | 8. 14 |
| Optimuma pH | 7.0-8.0 |
| Optimuma temperaturo | 65 °C |
| Substratospecifo | Fendado de glikozidaj ligoj inter GlcNAc kaj asparagin-restaĵoj Fig.1 |
| Rekonaj ejoj | N-ligitaj glikanoj krom se ili enhavas α1-3-fukozon Fig |
| Aktivigantoj | TDT |
| Inhibitoro | SDS |
| Stoka temperaturo | -25 ~ -15 ℃ |
| Malaktivigo de Varmo | 20µL reagmiksaĵo enhavanta 1µL da PNGase F estas inaktivigita per kovado je 75 °C dum 10 minutoj. |
Fig. 1 Substratospecifo de PNGase F
Fig. 2 Rekonaj sidoj de PNGase F.
Kiam la internaj GlcNAc-restaĵoj estas ligitaj al α1-3 fukozo, PNGase F ne povas fendi N-ligitajn oligosakaridojn de glikoproteinoj.Ĉi tiu modifo estas ofta en plantoj kaj kelkaj insektaj glikoproteinoj.
Ckomponantoj
|
| Komponentoj | Koncentriĝo |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | 10×Glycoprotein Denaturing Buffer | 1000 µl |
| 3 | 10×GlycoBuffer 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
Unuodifino
Unu unuo (U) estas difinita kiel la kvanto de enzimo bezonata por forigi >95% de la karbonhidrato de 10 µg da denaturigita RNase B en 1 horo je 37 °C en totala reagvolumeno de 10 µL.
Reagkondiĉoj
1. Solvu 1-20 µg da glikoproteino kun dejonigita akvo, aldonu 1 µl 10×Glycoprotein Denaturing Buffer kaj H2O (se necese) por fari 10 µl totalan reaktan volumon.
2.Kovu je 100 °C dum 10 minutoj, malvarmigu ĝin sur glacio.
3.Aldonu 2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 kaj miksi.
4.Aldonu 1-2 µl PNGazon F kaj H2O (se necese) fari 20 µl entutan reaktan volumon kaj miksi.
5.Kovu reagon je 37 °C dum 60 min.
6.Por SDS-PAGE-analizo aŭ HPLC-analizo.
