mRNA Cap2'-O-Metiltransferazo
mRNA Cap 2´ -O-metiltransferazo estis derivita de rekombina E. coli-trostreĉiĝo kiu portas la genon por la vaccinia mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase.Ĉi tiu enzimo aldonas metilgrupon ĉe la 2'-O pozicio de la unua nukleotido najbara al la ĉapostrukturo ĉe la 5'fino de la RNA. La enzimo utiligas S-adenosilmetioninon (SAM) kiel metildonacanton por metiligi kapitan RNA (ĉapo). -0) rezultanta en kap- 1 strukturo.
La strukturo Cap1 povas pliigi la tradukan efikecon, plibonigante la esprimon de mRNA en transfekto kaj mikroinjekto eksperimentoj. Ĉi tiu enzimo specife postulas RNA kun m7GpppN ĉapo kiel substrato.Ĝi ne povas utiligi RNA kun pN, ppN, pppN aŭ GpppN ĉe la 5´-fino.Kapita RNA povas esti preparita per en vitra transskribo uzanta ĉapon analogon aŭ tra enzimeca ĉapo uzanta la Vaccinia Kaŝan Enzimon.
Komponentoj
mRNA-Ĉapo 2´-O-Metiltransferazo (50U/μL)
10×Limiga Reago-Bufro
Stokado
-25 ~- 15 ℃ por stokado ( Evitu ripetajn frostig-degelon ciklojn)
Stokado bufro
20 mM Tris-HCl (pH 8.0,25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0. 1 mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% glicerolo.
Unuodifino
Unu unuo estas difinita kiel la kvanto de enzimo postulata por metiligi 10 pmoles da 80 nt-kapa RNA-transskribo en 1 horo je 37 °C.
Kvalitkontrolaj provoj
Eksonukleazo: 50U de mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase kun 1μg λ-Hind III digesta DNA je 37 ℃ dum 16 horoj donas neniun degeneron kiel determinite per agarose-ĝelelektroforezo.
Endonukleazo: 50 U de mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase kun 1 μg λDNA je 37 ℃ dum 16 horoj donas neniun degeneron kiel determinite per agarose-ĝelelektroforezo.
Nickase: 50U de mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase kun 1μg pBR322 je 37 ℃ dum 16 horoj donas neniun degeneron kiel determinite per agarose-ĝelelektroforezo.
RNazo: 50U de mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase kun 1.6μg MS2 RNA dum 4 horoj je 37℃ donas neniun degeneron kiel determinite per agarose-ĝelelektroforezo.
E. coli DNA: 50U de mRNA Cap 2 ´ -O-metiltransferazo estas ekzamenitaj por la ĉeesto deE. coli genoma DNA uzante TaqMan qPCR kun enkondukoj specifa por laE. coli 16S rRNA-lokuso.LaE. coli genoma DNA-poluado estas =1E. coli genaro.
Bakteria Endotoksino: LAL-testo, laŭ Ĉina Farmakopeo IV 2020 eldono, ĝela limo-testmetodo, ĝenerala regulo (1143).La enhavo de bakteria endotoksino devus esti =10 EU/mg.
Reagsistemo kaj kondiĉoj
1. Kombinu taŭgan kvanton de Kapita RNA kaj RNase-libera H2O en 1.5 mL mikrofuge tubo al fina volumeno de 16.0 µL.
2. Varmigu je 65℃ dum 5 minutoj, kaj poste glacia bano dum 5 minutoj.
3. Aldonu la sekvajn komponantojn en la specifita ordo (por metiligo de Kapita RNA
malpli ol 10
Komponanto | Volumo |
Sennatura ĉapelita RNA | 16 μL |
10X Kapa Reago-Bufro* | 2 μL |
SAM (4 mM) | 1 μL |
mRNA-Ĉapo 2´-O-Metiltransferazo (50 U/μL) | 1 μL |
ddH2O | Al 20 μL |
*10× Kapa Reakcia Bufro: 500 mM Tris-HCl (pH 8.0, 25℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.
4. Inkubi je 37℃ dum 1 horo (2 horoj da kovado estas rekomendita por la cela fragmento malpli ol 200 nt).
Aplikoj
Plibonigi mRNA-esprimon dum mikroinjekto kaj transfektaj eksperimentoj.
Notoj pri uzo
1. Antaŭ reago, RNA devas esti purigita kaj solvita en nuclease-libera akvo, ĉiuj solvoj ne entenu EDTA kaj jonojn.
2. Oni rekomendas varmigi la specimenan RNA je 65℃ dum 5 minutoj antaŭ la reago por forigi la sekundaran strukturon ĉe la 5'fino de la transskribo.Ĝi povus esti etendita ĝis 10 min por kompleksa 5 ´ -fina strukturo.