Duobla senhelpa RNA (dsRNA) ELISA KIT

Ĉi tiu ilaro estas Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) kuplado kun biotino-Streptavidin-sistemo, por kvanta mezurado de dsRNA kun longo super 60 bazparoj (bp), sendepende de la sekvenco.La plato estis antaŭ-tegita per kontraŭ-dsRNA-antikorpo.dsRNA ĉeestanta en la provaĵo estas aldonita kaj ligas al antikorpoj kovritaj sur la putoj.Kaj tiam biotinilata kontraŭ-dsRNA-antikorpo estas aldonita kaj ligas al dsRNA en la specimeno.Post lavado, HRP-Streptavidin estas aldonita kaj ligas al la Biotinilata kontraŭ-dsRNA-antikorpo.Post inkubacio neligita HRP-Streptavidin estas forlavita.Tiam TMB-substrato solvo estas aldonita kaj katalizita de HRP por produkti bluan kolorprodukton kiu ŝanĝiĝis al flava post aldonado de acida haltsolvo.La denseco de flava estas proporcia al la celkvanto de dsRNA kaptita en plato.La absorbanco estas mezurita je 450 nm.

Apliko

Ĉi tiu ilaro estas por kvanta mezurado de resta dsRNA.

Kit-komponantoj

Stokado kaj Stabileco

1. Por neuzata ilaro: La tuta ilaro povus esti stokita je 2~8℃ en breto.Forta lumo devas esti evitita por stoka stabileco.

2. Por uzata ilaro: Post kiam la mikroplato estas malfermita, bonvolu kovri neuzatajn putojn per telesigelo kaj reveni al la folio-sako enhavanta la sekigan pakon, zip-sigelu la folian sakon kaj revenu al 2~8℃ kiel eble plej baldaŭ post uzo.Aliaj reakciiloj devas esti resenditaj al 2~8℃ kiel eble plej baldaŭ post uzo.

Materialoj Bezonataj Sed Ne Liveritaj

1. Mikroplata leganto kun 450±10nm filtrilo (pli bone se povas detekti ĉe 450 kaj 650 nm ondolongo).

2. Mikroplata skuilo.

3. RNase-liberaj konsiletoj kaj centrifugaj tuboj.

Operacia Fluodiagramo

Antaŭ ol Vi Komencu

1. Alportu ĉiujn ilajn komponantojn kaj specimenojn al ĉambra temperaturo (18-25℃) antaŭ uzo.Se la ilaro ne estos eluzita en unu fojo, bonvolu elpreni nur striojn kaj reakcilojn por nuna eksperimento, kaj lasi la ceterajn striojn kaj reakciiloj en bezonata kondiĉo.

2. Lava bufro: diluu 40mL de 20× koncentrita lavbufro kun 760mL da dejonigita aŭ distilita akvo por prepari 800mL da 1× lava bufro.

3. Normo: mallonge turnu aŭ centrifugu la stokan solvon antaŭ uzo.La koncentriĝo de kvar normoj provizitaj estas 5ng/μL.Por UTP kaj pUTP dsRNA-normoj, bonvolu dilui la stokan solvon al 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL kun STE-bufro por desegni la norman kurbon.Por N1-Me-pUTP dsRNA-normoj, bonvolu dilui la stokan solvon al 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL kun STE-bufro por desegni la norman kurbon.Por 5-OMe-UTP dsRNA-normo, bonvolu dilui la stokan solvon al 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg/μL kun STE-bufro por desegni la norman kurbon.Ni rekomendas ke normoj povas esti diluitaj kiel sekvaj diagramoj:

4. Biotinilata detekta antikorpo kaj HRP-streptavidina laborsolvo: mallonge turnu aŭ centrifugu la stokan solvon antaŭ uzo.Diluu ilin al la laborkoncentriĝo kun dilua bufro.

5. TMB-subŝtato: aspiru la bezonatan dozon de la solvo per steriligitaj konsiletoj kaj ne forĵetu la restan solvon denove en la fiolon.TMB-subŝtato estas sentema al lumo, ne malkovru TMB-substato al lumo dum longa tempo.

Uzante protokolon

1. Determini la nombron da strioj necesaj por la provo.Enmetu la striojn en la kadrojn por uzo.Restaj platstrioj ne uzataj en ĉi tiu analizo devas esti repakitaj en la sako kun sekigilo.Fermu la sakon firme por fridigita konservado.

2. Aldonu 100μL ĉiun el diluoj de norma, malplena kaj specimenoj en la taŭgajn putojn.Kovru per la telesigelo.Kovu dum 1 horo ĉe ĉambra temperaturo kun skuado je 500rpm.La specimenoj devas esti diluitaj kun STE-bufro al taŭga koncentriĝo por preciza analizo.

3. Lava paŝo: Aspiru la solvon kaj lavu per 250μL lavbuffer al ĉiu puto kaj lasu ĝin stari dum 30s.Forĵetu lavbufferon tute klakante la teleron sur sorban paperon.Tute lavi 4 fojojn.

4. Aldonu 100μL da biotinilata detekta antikorpa laborsolvo en ĉiun puton.Kovru per la telesigelo.Kovu dum 1 horo ĉe ĉambra temperaturo kun skuado je 500rpm.

5. Ripetu lavan paŝon.

6. Aldonu 100μL da HRP-streptavidin laborsolvo en ĉiun puton.Kovru per la telesigelo.Kovu dum 30 minutoj ĉe ĉambra temperaturo kun skuado je 500 rpm.

7. Ripetu lavan paŝon denove.

8. Aldonu 100μL da TMB-substrata solvo en ĉiun puton.Kovru per la telesigelo.Kovu dum 30 minutoj ĉe RT Protektu kontraŭ lumo.La likvaĵo bluiĝos per aldono de substrata solvaĵo.

9. Aldonu 50μL da halta solvo en ĉiun puton.La likvaĵo flaviĝos per aldono de halta solvo.Poste rulu la mikroplatan legilon kaj faru mezuradon ĉe 450nm tuj.

Kalkulo de Rezultoj

1. Mezumu la duplikatajn legaĵojn por ĉiu normo, kontrolo kaj specimenoj kaj subtrahi la mezan nul-norman optikan densecon.Konstruu norman kurbon kun absorbo sur la vertikala (Y) akso kaj dsRNA-koncentriĝo sur la horizontala (X) akso.

2. Oni rekomendas fari la kalkulon per komputila kurb-adapta programaro kiel kurbsperta 1.3 aŭ ELISA Calc en 5 aŭ 4 parametra ne-linia taŭga modelo.

Agado

1. Sentemo:

pli malalta limo de detekto: ≤ 0.001pg/μL (por UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0.01pg/μL (por 5-OMe-UTP-dsRNA).

Malsupra limo de kvantado: 0,0156 pg/μL (por UTP-, pUTP-dsRNA), 0,0312 pg/μL (por N1-Me-pUTP-dsRNA), 0,0625 pg/μL (por 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Precizeco: CV de Intra-Assay ≤10%, CV de Inter-Assay ≤10%

3. Reakiro: 80% ~ 120%

4.Lineareco: 0,0156-0,5 pg/μL (porUTP-, pUTP-dsRNA) 0,0312-1 pg/μL (por N1-Me-pUTP dsRNA), 0,0625-1 pg/μL (por 5-OMe-UTP-dsRNA).

Konsideroj

1. TMB-reaga temperaturo kaj tempo estas kritikaj, bonvolu kontroli ilin strikte laŭ la instrukcio.

2. Por atingi bonan reprodukteblecon kaj sentemon de analizo, taŭga lavado de la teleroj por forigi troajn nereagajn reakciulojn estas esenca.

3. Ĉiuj reakciiloj devas esti miksitaj ĝisfunde antaŭ uzo kaj eviti bumbledojn dum specimeno aŭ aldono de reakciiloj.

4. Se kristaloj formiĝis en la koncentrita lavbufro (20x), varmigu ĝis 37℃ kaj miksi milde ĝis la kristaloj estas tute dissolvitaj.

5. Evitu analizon de specimenoj enhavantaj natrian azidon (NaN3), ĉar ĝi povus detrui la HRP-agadon rezultigante subtakson de la kvanto de dsRNA.

6. Evitu RNase-poluadon dum analizo.

7. La normo/specimeno, detekta antikorpo kaj SA-HRP ankaŭ povas esti kondukitaj ĉe RT sen skuado, sed ĉi tio povas kaŭzi malkreskon de detekta sentemo unuoble.Por ĉi tiu kazo, ni rekomendas ke UTP kaj pUTP dsRNA-normoj estu diluitaj de 2pg/μL, N1-Me-pUTP dsRNA-normoj estu diluitaj de 4pg/μL kaj 5-OMe-UTP dsRNA-normo estu diluita de 8pg/μL.Krome, inkuvu HRP-streptavidin laborsolvon dum 60 minutoj ĉe ĉambra temperaturo.Ne uzu flakon skuilon, ĉar flakskujon povas rezultigi malprecizan rezulton.

Tipa rezulto

1. Normaj kurbaj datumoj

2. Norma kurba kalkulo

3. Liner-detekta gamo: 0.0312- 1pg/μL